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熒光定量PCR儀使用時要注意以下幾點操作
點擊次數:403 更新時間:2022-10-19
     熒光定量PCR儀將熒光基團加入到PCR反應體系中,通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實時監測實現,再根據標準曲線定量分析未知模板的方法,即是熒光定量PCR技術。在實時熒光定量PCR中,實時檢測全程PCR擴增過程,按照反應時間和熒光信號的變化能夠將一條曲線繪制成。
  混合模板DNA和有熒光素的Taqman探針,遵守聚合酶鏈反應規律使高溫變性,低溫復性,適溫延伸的熱循環完成,切斷和模板DNA互補配對的Taqman探針,熒光素在反應體系中游離。熒光在特定光激發下發出,被擴增的目的基因片段隨著循環次數的增加呈指數級增長,Ct值根據實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度求取出來,同時對照多個已知模板濃度的標準品,就能夠使待測標本目的基因的拷貝數得出。
  熒光定量PCR儀需要規范樣品核酸提取和實時熒光擴增時的操作,避免樣品交叉污染,酶被降解,出現假陽性的情況。
 ?。?)根據試驗的分區嚴格操作,按照提取區、擴增區、檢測區單方向流動,不能夠逆向流動物品、樣品和試劑。
 ?。?)在對多份樣品進行操作的時候,制備反應混合液,首先混合好熒光PCR反應液、熒光探針和酶。之后在每個PCR管中進行分裝,如此不僅會使操作次數減少,而且能夠使污染避免,還能夠使反應的精確度增加。
 ?。?)在對樣品和蛋白酶k添加的過程中,要對避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。
 ?。?)在操作的時候,需要將陰性及陽性對照設立,能夠對熒光PCR反應的準確性和可信性進行驗證。
 ?。?)使用的離心管、槍頭和PCR管需要確保沒有污染,或者將它們進行高壓滅菌。
 ?。?)在完成核酸的提取之后應當立刻進行儀器的擴增,不能夠在室溫環境下過長時間放置提取的核酸,空氣中的酶能夠輕易的將其降解,其可以在-70℃冰箱內長期保存,在-20℃冰箱內短期保存。
 ?。?)因為產物氣溶膠或標本DNA會很容易對移液器造成污染,所以需要使用可高壓處理的移液器。
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